測定發(fā)酵過程中微生物菌體的數(shù)量和菌體的生長情況,對發(fā)酵過程的控制和發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)控制具有十分重要的意義,本項研究探討了利用葡萄糖生物傳感器,測定發(fā)酵過程中微生物活細(xì)胞的方法及測定條件。
 一、 測定原理:
 微生物細(xì)胞在其生長或生活過程中,總是優(yōu)先利用葡萄糖作為基本能源和碳源,在細(xì)胞沒有營養(yǎng)限制因素的條件">

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用葡萄糖生物傳感器測定發(fā)酵過程微生物活細(xì)胞數(shù)研究

測定發(fā)酵過程中微生物菌體的數(shù)量和菌體的生長情況,對發(fā)酵過程的控制和發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)控制具有十分重要的意義,本項研究探討了利用葡萄糖生物傳感器,測定發(fā)酵過程中微生物活細(xì)胞的方法及測定條件。
 一、 測定原理:
 微生物細(xì)胞在其生長或生活過程中,總是優(yōu)先利用葡萄糖作為基本能源和碳源,在細(xì)胞沒有營養(yǎng)限制因素的條件下,微生物對葡萄糖的利用數(shù)量與微生物細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞所處的生長時期有關(guān),微生物發(fā)酵過程中,一定的發(fā)酵時期微生物細(xì)胞處于一定的生長期,所以可以通過測定細(xì)胞對葡萄糖的利用量來估測細(xì)胞的數(shù)量。
  固定化酶葡萄糖生物傳感器測定靈敏度高,測定速度快,能夠滿足細(xì)胞測定的要求。
 二 測定裝置:
 待測樣品和葡萄糖加入到恒溫培養(yǎng)池內(nèi)開始計時,到設(shè)定的第一次采樣時間后,開動蠕動泵采樣約0.5ml,到菌體滅活池,采樣時蠕動泵正反方向運行相同時間,采樣結(jié)束后管道內(nèi)不存液體。再過20分鐘,再次取樣0.5ml,定時采樣控制由微型計算機系統(tǒng)自動完成。采樣后手工完成采集樣品的葡萄糖含量測定。葡萄糖含量與細(xì)胞數(shù)的轉(zhuǎn)換也由微型計算機系統(tǒng)完成,不同細(xì)胞的生長時期,葡萄糖的利用與菌體數(shù)的關(guān)系,通過切換轉(zhuǎn)換模式實現(xiàn)。




 

三、 測定結(jié)果
 1.不同濃度的微生物細(xì)胞對葡萄糖的利用情況
以下是我們對搖瓶培養(yǎng)23小時的釀酒酵母發(fā)酵液多級稀釋后,20分鐘時間實際消耗葡萄糖的測定結(jié)果,表中細(xì)胞濃度通過平板培養(yǎng)計數(shù)法測定。


表一:不同稀釋比例釀酒酵母發(fā)酵液20分鐘耗糖值

把上表的平均值數(shù)據(jù)按細(xì)胞濃度作圖,如結(jié)果如下:



  

實驗結(jié)果顯示,當(dāng)細(xì)胞濃度低于2×107時菌體對葡萄糖的利用速度較快,當(dāng)菌體濃度高于2×107后,葡萄糖的消耗與菌體濃度有較好的線性關(guān)系,在作計數(shù)測定時,必須對此非線性提供補償。
 2. 樣品的重復(fù)測定試驗:
實驗結(jié)果是否能重復(fù)是測定方法是否可行的根本依據(jù),為了驗證葡萄糖消耗法測試細(xì)胞數(shù)這一方法,我們分別對二次搖瓶培養(yǎng)的釀酒酵母作了重復(fù)計數(shù)測定,實驗結(jié)果顯示:對于同一樣品,儀器測定有較好的重復(fù)性,測定誤差小于10%。

表二:釀酒酵母發(fā)酵原液6次測定實驗結(jié)果


表三:釀酒酵母用磷酸緩沖液稀釋5倍后,測定6次實驗結(jié)果


 3. 測量范圍
 實際測定的數(shù)據(jù)顯示,本儀器測定的微生物細(xì)胞數(shù)的分辨率為106數(shù)量級,當(dāng)微生物細(xì)胞數(shù)小于這個數(shù)量級時,葡萄糖生物傳感器的測定精度和細(xì)胞對葡萄糖消耗的非線性使測定結(jié)果誤差太大,失去參考價值。
 四、 小結(jié)
 利用微生物活細(xì)胞對葡萄糖的消耗數(shù)量,推測微生物活細(xì)胞的數(shù)量,原理明確、操作簡便,測定可靠性高,但需要對不同的細(xì)胞生長期建立葡萄糖消耗與細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)模型,保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于工業(yè)微生物發(fā)酵生產(chǎn),因為發(fā)酵的條件基本一致,所以模型建立相對容易,本方法具有實用價值,當(dāng)發(fā)酵異常時,測得的細(xì)胞數(shù)可能不準(zhǔn),但異常的數(shù)據(jù)能對發(fā)酵控制提供及時的警告信息。

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